选择合适的克隆位点，并对载体进行线性化。尽量选择无重复序列且载体克隆位点上下游20bp区域内GC含量在40%-60%之间的位点进行克隆。载体线性化方式有限制性内切酶酶切消化和反向PCR扩增。1）酶切制备线性化载体时，推荐使用双酶切线性化，线性化wqn全5.1 制备线性化载体
一步克隆试剂盒 克隆系列

一步克隆试剂盒

一步克隆试剂盒 克隆系列

产品货号：CLO01

产品名称：一步克隆试剂盒

产品规格：20T/10μL/T/50T/10μL/T

产品简介：

NobleRyder® One Step Cloning Kit是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆技术，可以将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。可以高效兼容1-5个片段同源重组，50℃反应10 - 30 min即可进行连接，适用于快速克隆，DNA定点突变等。

实验流程

1.制备线性化载体

选择合适的克隆位点，并对载体进行线性化。尽量选择无重复序列且载体克隆位点上下游20bp区域内GC含量在40%-60%之间的位点进行克隆。载体线性化方式有限制性内切酶酶切消化和反向PCR扩增。1）酶切制备线性化载体时，推荐使用双酶切线性化，线性化wan全5.1 制备线性化载体

选择合适的克隆位点，对载体进行线性化。选择载体克隆位点附近无重复序列且上下游20bp区域内GC含量在40%-60%之间的位点进行克隆。

1）酶切制备线性化载体，推荐使用双酶切方案；单酶切线性化并不影响无缝链接，但可能会有更多的环状质粒残留，增加后期克隆的筛选难度。

2）反向PCR扩增制备线性化载体，必须使用高保真DNA聚合酶进行载体扩增，以减少扩增突变的引入。PCR产物需要进行胶回收，减少环状质粒环状DNA模板的残留。

2.制备插入片段

通过在插入片段正、反向引物5，端引入15-25bp线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5，端和3，端的末端分别带有与线性化载体的两个末端对应的wan全一致的序列。使用高保真PCR Mix完成扩增，获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳分析，并回收正确的产物片段。

插入片段正向扩增引物设计方式：

5’-上游载体末端同源序列+酶切位点（保留或删除）+基因特异性正向扩增引物序列-3’

插入片段反向扩增引物设计方式：

3’-基因特异性反向扩增引物序列+酶切位点（保留或删除）+下游载体末端同源序列-5’

3.线性化载体与插入片段浓度测定

使用NanoDrop或Qubit检测线性化载体和插入片段的浓度。

4.重组反应体系的配制

1）线性化载体和插入片段使用量计算

载体与插入片段摩尔比为1:2 ~ 1:3；当插入片段长度大于克隆载体时，将插入片段当作克隆载体，克隆载体当作插入片段计算。

2）在冰上配制反应体系：

3）使用移液器轻轻吸打混匀并瞬时离心。

4）50℃反应20min， 4℃维持或取出后置于冰上冷却。

5）重组反应转化、涂板，具体方法参照感受态细胞的说明书。

一步克隆试剂盒 克隆系列