TrxR 催化NADPH 还原DTNB 生成TNB 和NADP+，TNB 在 412 nm 有特征吸收峰，通过测定 412nm波长处TNB 的增加速率，即可计算TrxR 活性。
硫氧还蛋白氧化还原酶试剂盒 谷胱gan肽系列

硫氧还蛋白氧化还原酶（thioredoxin reductase, TrxR）试剂盒说明书

分光光度法 50 管/48 样

硫氧还蛋白氧化还原酶试剂盒 谷胱gan肽系列

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

TrxR 是一种NADPH 依赖的包含FAD 结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR 与GR 活性类似，催化 GSSG 还原生成GSH，是谷胱gan肽氧化还原循环关键酶之一。

测定原理：

TrxR 催化NADPH 还原DTNB 生成TNB 和NADP⁺，TNB 在 412 nm 有特征吸收峰，通过测定 412nm波长处TNB 的增加速率，即可计算TrxR 活性。

组成：

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5 ml 蒸馏水溶解。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、可调节移液器、1ml 玻璃比色皿和蒸馏水。

粗酶液提取：

组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g， 4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

血清等液体：直接测定。

TrxR 测定操作：

分光光度计预热 30 min，调节波长到 412nm，用蒸馏水调零。

试剂一在 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）预热 30min。

测定管：取 1ml 玻璃比色皿，加入 100μl 试剂二，100μl 试剂三，700μl 试剂一，100μl 上清液，迅速混匀后于 412 nm 测定 10 s 和 310 s 吸光度，记为A3 和A4。△A 测定管=A2-A1。

TrxR 活性计算公式：

按蛋白浓度计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。

TrxR（nmol/min /mg prot）=△A 测定管÷ε÷d×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T

= 147×△A 测定管÷Cpr

按样本质量计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样本每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。

TrxR（nmol/min /g 鲜重）=△A 测定管÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T

= 147×△A 测定管÷W

按细胞数量计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每 104 个细胞每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。

TrxR（nmol/min/104 cell）=△A 测定管÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T

= 147×△A 测定管÷ 细胞数量

按液体体积计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。

TrxR（nmol/min /ml）=△A 测定管÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T

= 147×△A 测定管

ε：TNB 在 412nm 处的微摩尔消光系数，0.0136 L/μ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积（L），1000μl=0.001 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/ml），需要另外测定；V 样：加入反应体系中上清液体积（ml），100μl=0.1 ml；V 样总：加入提取液体积，1ml；W，样本质量，g；T：反应时间（min）， 5 min。

注意事项:

测定前须先取 1～2 个样做预实验，哺乳动物组织及血液制品TrxR 活力测定时，一般须用蒸馏水稀释5 倍左右；测定过程操作须迅速。

试剂二和试剂三配制好后 3 天内使用完。

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