GR 能催化NADPH 还原GSSG 再生GSH，同时NADPH 脱氢生成NADP+；NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，相反NADP+在该波长无吸收峰；通过测定 340 nm 吸光度下降速率来测定 NADPH 脱氢速率，从而计算GR 活性。
谷胱gan肽还原酶

谷胱gan肽还原酶（glutathione reductase, GR）说明书

分光光度法 50 管/48 样

谷胱gan肽还原酶

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

GR 是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱gan肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中 GR 被TrxR 取代）。GR 催化NADPH 还原GSSG 生成GSH，有助于维持体内 GSH/GSSG比值。GR 在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR 还参与抗坏血酸－谷胱gan肽循环途径。

测定原理：

GR 能催化NADPH 还原GSSG 再生GSH，同时NADPH 脱氢生成NADP⁺；NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，相反NADP⁺在该波长无吸收峰；通过测定 340 nm 吸光度下降速率来测定 NADPH 脱氢速率，从而计算GR 活性。

组成：

试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存。临用前加入 3 ml 蒸馏水，混匀。试剂三：粉剂×2 支，-20℃保存。临用前加入 1.5 ml 蒸馏水，混匀。

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、1ml 石英比色皿和蒸馏水

粗酶液提取：

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。

细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g， 4℃，离心 15min，取上清置于冰上待测。

血清等液体：直接测定。

操作步骤：

分光光度计预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。

试剂一置于 25℃（普通物质）或者 37℃（哺乳动物）中预热 30min。

测定管：取 1ml 石英比色皿，依次加入 50μl 试剂三，100μl 试剂二， 750μl 试剂一，100μl 上清液，混匀，于 340nm 迅速测定初始吸光度和 180 s 吸光度，记为 A 测 1 和A 测 2，△A 测定管= A 测 1﹣A 测 2。 (注意加完上清液后迅速混匀测定)

计算公式：

按蛋白浓度计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷[Cpr×V 样]÷T

= 536×△A 测定管÷Cpr

按样本质量计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每克样本每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/g 鲜重)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×109] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T

= 536×△A 测定管÷W

(3) 按细胞数量计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每 104 个细胞每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×109] ÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T

= 536×△A 测定管÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫升液体每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/ml)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷×V 样÷T

= 536×△A 测定管

ε：NADPH 摩尔消光系数6.22×103L/mol/cm；V 反总：反应体系总体积，1000μl=0.001 L；106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白浓度（mg/ml）；V 样：加入反应体系中上清液体积，100μl =0.1 ml；V 样总：加入提取 液体积，1ml；W，样本质量，g；T：反应时间，3 min。

注意事项：

样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；

试剂二和试剂三须现配现用，配制完后，置于冰上，未使用完的 4℃保存，三天内使用完。

测定前须先用 1～2 个样做预实验，哺乳动物组织一般须用试剂一稀释 2～5 倍。

细胞中 GR 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中 GR 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。