磷脂酶D 催化水解磷脂酰dan碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和dan碱，dan碱在dan碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将 4-氨基安ti比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在 500nm 处有特征吸收峰。
磷脂酶D试剂盒 脂肪酸系列

磷脂酶D（ Phospholipases D，PLD ）试剂盒说明书

微量法 100T/96S

磷脂酶D试剂盒 脂肪酸系列

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

磷脂酶 D（EC3.1.4.4）即磷脂酰dan碱水解酶，是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中，具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。

测定原理：

磷脂酶D 催化水解磷脂酰dan碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和dan碱，dan碱在dan碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将 4-氨基安ti比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在 500nm 处有特征吸收峰。

组成：

试剂三：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加 1ml 无水乙醇充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

自备仪器和用品：

天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。

酶液提取：

组织：按照质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1ml 提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 离心 30min，弃上清，取沉淀溶于 1ml 试剂一。

细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后于 4℃，10000g离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 离心 30min，弃上清，取沉淀溶于 1ml 试剂一。

血清：直接测定。

测定操作：

酶活计算公式：

用微量石英比色皿测定的计算公式如下

按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰dan碱产生 1nmol dan碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD 活性（nmol/min /mg prot）=

A测定管 ×C 标准÷Cpr÷T= 16.7× A测定管 ÷Cpr

按照样本质量计算

A标准管

A标准管

酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰dan碱产生 1nmol dan碱所需的酶量为一个酶活力单位

PLD 活性（nmol/min /g 鲜重）=

A测定管 ×C 标准÷W÷T = 16.7× A测定管 ÷W 

按照细胞数量计算

A标准管

A标准管

酶活性定义：每 104 个细胞每分钟水解磷脂酰dan碱产生 1nmol dan碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD 活性（nmol/min /10⁴ cell）=

A测定管 ×C 标准÷细胞数量÷T = 16.7× A测定管 ÷细胞数量 

按照液体体积计算

A标准管

A标准管

酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰dan碱产生 1nmol dan碱所需的酶量为一个酶活力单位。 

PLD 活性（nmol/min /ml）=

A测定管 ×C 标准÷T=16.7× A测定管

A标准管     A标准管

C 标准：标准品浓度，500nmol/ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g/ml；T：反应时间，30min

用 96 孔板测定的计算公式如下

按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰dan碱产生 1nmol dan碱所需的酶量为一个酶活力单位。

 PLD 活性（nmol/min /mg prot）=

A测定管 ×C 标准÷Cpr÷T= 16.7× A测定管 ÷Cpr

按照样本质量计算

A标准管

A标准管

酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰dan碱产生 1nmol dan碱所需的酶量为一个酶活力单位。

 PLD 活性（nmol/min /g 鲜重）=

A测定管 ×C 标准÷W÷T = 16.7× A测定管 ÷W

按照细胞数量计算

A标准管

A标准管

酶活性定义：每 10⁴ 个细胞每分钟水解磷脂酰dan碱产生 1nmol dan碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD 活性（nmol/min /10⁴ cell）=

A测定管 ×C 标准÷细胞数量÷T = 16.7× A测定管 ÷细胞数量按照液体体积计算

A标准管

A标准管

酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰dan碱产生 1nmol dan碱所需的酶量为一个酶活力单位。

 PLD 活性（nmol/min /ml）=

A测定管 ×C 标准÷T=16.7× A测定管

A标准管     A标准管

C 标准：标准品浓度，500nmol/ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g/ml；T：反应时间，30min

注意事项：

显色完成后，若有沉淀，于 8000rpm，25℃离心 5min 后取上清测定。

吸光值不宜超过 1，否则用试剂一将酶液进行稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。

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