ICDHm（EC 1.1.1.41）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，在三羧酸循中催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸，同时将 NAD+ 还原为NADH，是三羧酸循环的限速酶之一，其催化的反应是细胞 NADH 主要来源之一。
线粒体异柠檬酸脱氢酶试剂盒 三羧酸

线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm）试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

线粒体异柠檬酸脱氢酶试剂盒 三羧酸

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

ICDHm（EC 1.1.1.41）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，在三羧酸循中催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸，同时将 NAD⁺ 还原为NADH，是三羧酸循环的限速酶之一，其催化的反应是细胞 NADH 主要来源之一。

测定原理：

ICDHm 催化NAD⁺ 还原生成NADH，导致 340nm 处光吸收上升。

组成：

自备仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1ml 试剂一和 10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。

3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 ICDHm（此步可选做）。

5、 在步骤④的沉淀中加入 200μl 试剂二和 2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 ICDHm 活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

在试剂五中加入 18ml 试剂四充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

在试剂六中加入 1ml 蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 样本、10μl 试剂六和 180μl 试剂五，混匀，立即记录 340nm

处 20s 时的吸光值A1 和 2min20s 后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

ICDHm 活性计算：

用微量石英比色皿测定的计算公式如下

按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活性单位。

ICDHm 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 样) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟生成 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活性单位。

ICDHm（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=325×ΔA÷W

按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活性单位。

ICDHm 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.65×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.01 ml；V 样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

用 96 孔板测定的计算公式如下

按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活性单位。

ICDHm 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟生成 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活性单位。

ICDHm（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=650×ΔA÷W

按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活性单位。

ICDHm 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.3×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm； V 样：加入样本体积，0.01 ml；V 样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

线粒体异柠檬酸脱氢酶试剂盒 三羧酸