PK 催化磷酸烯醇式丙tong酸和ADP 生成ATP 和丙tong酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH 和丙tong酸生成乳酸和NAD+，在 340nm 下测定NADH 下降速率，即可反映 PK 活性。
丙tong酸激酶试剂盒 糖酵解

丙tong酸激酶（Pyruvate kinase，PK）试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

丙tong酸激酶试剂盒 糖酵解

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

PK（EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的最后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生ATP 的关键酶之一，因此测定PK 活性具有重要意义。

测定原理：

PK 催化磷酸烯醇式丙tong酸和ADP 生成ATP 和丙tong酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH 和丙tong酸生成乳酸和NAD⁺，在 340nm 下测定NADH 下降速率，即可反映 PK 活性。

组成：

自备仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

试剂二的配制：临用前取试剂二一瓶，加入 9ml 试剂一和 1.06ml 蒸馏水充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；现配现用。

试剂三的配制：临用前取试剂三一支，加入 0.6ml 蒸馏水充分溶解待用；现配现用。

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 样本、10μl 试剂三和 180μl 试剂二，混匀，立即记录 340nm处 20s 时的吸光值A1 和 2min20s 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

PK 活性计算：

用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1、血清（浆）中 PK 活力的计算:

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=1608×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 PK 活力的计算:

按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PK（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=1608×ΔA÷W

按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=3.216×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.01 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

用 96 孔板测定的计算公式如下：

1、血清（浆）中 PK 活力的计算:

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PK（nmol/min /ml）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=3216×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 PK 活力的计算:

按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PK（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=3216×ΔA÷W

按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=6.432×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm； V 样：加入样本体积，0.01 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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