PEPC 催化磷酸烯醇式丙tong酸和CO2 生成草xian乙酸和HPO42-，苹果suan脱氢酶进一步催化草xian乙酸和 NADH 生成苹果酸和NAD+，在 340nm 测定NADH 减少速率，计算PEPC 活性。
磷酸烯醇式丙tong酸羧化酶试剂盒 糖酵解

磷酸烯醇式丙tong酸羧化酶（PEPC)试剂盒说明书

分光光度法 50 管/48 样

磷酸烯醇式丙tong酸羧化酶试剂盒 糖酵解

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

PEPC（EC 4.1.1.31）广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，是催化磷酸烯醇式丙tong酸与二氧化碳反应生成草xian乙酸呈不可逆反应的酶，对三羧酸循环的运转起重要调节作用。

测定原理：

PEPC 催化磷酸烯醇式丙tong酸和CO2 生成草xian乙酸和HPO4^2-，苹果suan脱氢酶进一步催化草xian乙酸和 NADH 生成苹果酸和NAD⁺，在 340nm 测定NADH 减少速率，计算PEPC 活性。

组成：

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 ml 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、试剂五工作液的配制：将试剂五原液：试剂五稀释液=1μl:329μl 稀释，用多少配多少。

3、将试剂一、二、三、四和试剂五工作液置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 5 分钟。加样表：

将上述试剂按顺序加入 1 ml 石英比色皿中，立即混匀，加样本的同时开始计时，340 nm 波长下记录初始吸光度A1 和反应 5 分钟后的吸光度A2。计算ΔA=A1-A2。

注意事项：如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三、四、和试剂五工作液按比例配成混合液。

PEPC 活性计算：

1、血清（浆）PEPC 活力计算

单位定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/ml））＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=1624×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 PEPC 活力计算

按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1624×ΔA÷Cpr

按样本鲜重计算

单位定义：每g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=1624×ΔA÷W

按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=3.248×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1.010×10-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.02 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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