NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD 的再生，而且与免疫反应密切相关。
NADH 氧化酶试剂盒 辅酶Ⅰ

NADH 氧化酶（NADH oxidase，NOX）试剂盒说明书

分光光度法 50 管/48 样

NADH 氧化酶试剂盒 辅酶Ⅰ

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD 的再生，而且与免疫反应密切相关。

测定原理：

NOX 能够将NADH 氧化为NAD，NADH 的氧化与 2,6 二lu酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP 被还原为无色的DCPIP，在 600nm 下测定蓝色DCPIP 的还原速率计算出 NADH 氧化酶活性的大小。

组成：

试剂六：粉剂×2 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 5ml 蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml 玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1ml 试剂一和 10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。将匀浆 600g，4℃离心 5min。

弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的NOX（此步可选做）。

步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 200μl 试剂二和 2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于NOX 活性测定。

血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 600nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

试剂四、试剂五和试剂六于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min。

在 1ml 石英比色皿中加入 40μl 样本、700μl 试剂四、100μl 试剂五和 160μl 试剂六，混匀，记录 600nm

处 20s 时吸光值A1 和 1min20s 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

NOX 活力单位的计算:

1、血清（浆）NOX 活力的计算:

单位的定义：每ml 血清（浆）在每ml 反应体系中每分钟A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/ml）＝ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T=2500×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 NOX 活力的计算:

按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白在每ml 反应体系中每分钟A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织在每ml 反应体系中每分钟A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/g 鲜重）=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在每 ml 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/104 cell）=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1ml； V 样：加入样本体积，0.04ml；V 样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量；500：细胞或细菌总数，500 万。

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