细胞色素P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。NCR 作为P450 酶系的重要一员，催化氧化型 P450 还原再生。
NADPH-细胞se素C 还原酶NCR试剂盒P450

NADPH-细胞se素C 还原酶（NCR）试剂盒说明书

分光光度法 50 管/48 样

NADPH-细胞se素C 还原酶NCR试剂盒P450

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做测定

测定意义：

细胞色素P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。NCR 作为P450 酶系的重要一员，催化氧化型 P450 还原再生。

测定原理：

NCR 催化NADPH 还原氧化型细胞se素 c 生成还原型细胞se素 c，还原型细胞se素 c 在 550nm 处有特征吸收峰；通过测定 550nm 吸光度的增加速率，来计算 NCR 活性。

组成：

试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 100ml 蒸馏水充分溶解。

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存。临用前配制，加 2.6 ml 蒸馏水充分溶解，4℃保存。试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前配制，加 550 μl 蒸馏水充分溶解，4℃保存。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、1ml 玻璃比色皿和蒸馏水。

粗酶液提取：

1、除去细胞核和线粒体等：称约 0.5g 组织，加入 4℃预冷的 1 ml 试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心 30min，取上清液，转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心 60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1 ml 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min，弃上清液。

4、最终微粒体：向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5 ml，盖紧后充分震荡溶解，4℃保存待测。

测定操作：

分光光度计预热 30 min，调节波长到 550 nm，蒸馏水调零。

试剂二在 37℃水浴中预热 30min。

空白管：取 1ml 玻璃比色皿，依次加入 50μl 蒸馏水、900μl 试剂二、50μl 试剂三和 10μl 试剂四，迅速混匀后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化，第 10 s 和第 130 s 吸光值分别记为 A1 和A2，△A 空白管=A2-A1。

测定管：取 1ml 玻璃比色皿，依次加入 50μl 粗酶液、900μl 试剂二、50μl 试剂三和 10μl 试剂四，迅速混匀后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化，第 10 s 和第 130 s 吸光值分别记为 A3 和A4，△A 测定管=A4-A3。

注意：空白管只需要做一次。

计算公式：

(1).按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol 还原型细胞se素 C 为 1 个酶活单位。

NCR 酶活性 (nmol/min/mg prot)= (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T

= 529×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

(2)按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中，每克样品每分钟催化产生 1nmol 还原型细胞se素 C 为 1 个酶活单位。

NCR 酶活性(nmol/min/g 鲜重)= (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷（W×V 样÷V 样总）÷ T

= 265×(△A 测定管-△A 空白管)÷W

ε：还原型细胞se素C 摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，1010μl=0.00101L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/ml，需要另外测定；V 样：加入反应体系中上清液体积，50μl=0.05ml；V 样总：加入提取液体积，0.5ml；W：样本质量，g；T：反应时间，2min。

注意事项：

试剂三、试剂四临用前配制，配好未使用完的 4℃可保存两天。

NADPH-细胞se素C 还原酶NCR试剂盒P450