AKP 是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝an酸蛋白酶。此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。
碱性蛋白酶活性测定试剂盒

碱性蛋白酶（Alkaline protease, AKP）活性测定试剂盒说明书

分光光度法 50 管/24 样

碱性蛋白酶活性测定试剂盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

AKP 是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝an酸蛋白酶。此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。

测定原理：

在碱性条件下，AKP 水解酪蛋白生成酪an酸；在碱性条件下，酪an酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在680nm 有特征吸收峰，测定 680nm 吸光度增加速率，来计算AKP 活性。

组成：

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 10 ml 蒸馏水溶解。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 20 ml 试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。（可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热 15-30 分钟，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用）。

试剂四：粉剂×1 瓶， 4℃保存。临用前加 50 ml 蒸馏水溶解。

标准品：液体 1ml×1 支，0.25 μ mol/ml 标准酪an酸溶液，4℃保存。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 ml EP 管、1ml 玻璃比色皿和蒸馏水。

粗酶液提取：

组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即粗酶液。

血清或培养液：直接测定。

细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

测定操作：

分光光度计预热 30min，调节波长到 680 nm，蒸馏水调零。

试剂二、试剂三和试剂四置于 40℃水浴保温 30min。

对照管：取一支EP 管，加入 100μL 粗酶液（血清或培养液），200μL 试剂二，混匀后置于 40℃水浴保温 10min；加入 200μL 试剂三，混匀后 8000g ，4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入新的EP 管，再加

入 1000μL 试剂四，200μL 试剂五，混匀后置于 40℃水浴保温 20min，于 680nm 测定光吸收，记为A 对照管。

测定管：取一支EP 管，加入 100μL 粗酶液（血清或培养液），200μL 试剂三，混匀后置于 40℃水浴保温 10min；加入 200μL 试剂二，混匀后 8000g ，4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入新的EP 管，再加

入 1000μL 试剂四，200μL 试剂五，混匀后置于 40℃水浴保温 20min，于 680nm 测定光吸收，记为A 测定管。（注意与对照管不同，先加试剂三，后加试剂二）

空白管：取一支EP 管，加入 200μL 蒸馏水，1000μL 试剂四 200μL 试剂五，混匀后置于 40℃水浴保温

20min，于 680nm 测定光吸收，记为 A 空白管。

标准管：取 EP 管，加入 200μL 标准品，1000μL 试剂四，200μL 试剂五，混匀后置于 40℃水浴保温 20min，于 680nm 测定光吸收，记为A 标准管。

注意：空白管和标准管只需要测定一次。计算公式：

按照样本蛋白浓度计算

AKP 活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生 1nmol 酪an酸为 1 个酶活单位。

AKP 活性（nmol/min /mg prot）= C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总

÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷Cpr 2．按照样本质量计算

AKP 活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生 1 nmol 酪an酸为 1 个酶活单位。

AKP 活性（nmol/min /g 鲜重）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总÷

（W×V1÷V2）÷T= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷W

3. 按照液体体积计算

AKP 活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生 1nmol 酪an酸为 1 个酶活单位。

AKP 活性（nmol/min/ml）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总÷V1÷T= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）

1.  按照细胞数量计算

AKP 活性单位定义：30℃每 10⁴ 个细胞每分钟催化水解产生 1nmol 酪an酸为 1 个酶活单位。

AKP 活性（nmol/min /10⁴ cell）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总÷（细胞数量×V1÷V2）÷T= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷细胞数量

C 标准品：0.25 μ mol/ml 标准酪an酸溶液；V 反总：酶促反应总体积，0.5ml；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/ml）； V1：加入反应体系中粗酶液体积（ml），0.1 ml；V2：提取液总体积（ml），1ml；T：催化反应时间（min）， 10min；W：样品质量（g）。

注意事项：

临用前配制的试剂配置好后 3 天内使用完毕。

碱性蛋白酶活性测定试剂盒