二磷酸核酮糖羧化酶（EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着CO2 的固定，同时又制约着碳素向Calvin 循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。
二磷酸核酮糖羧化酶试剂盒 光合系列

二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）试剂盒

分光光度法

二磷酸核酮糖羧化酶试剂盒 光合系列

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

二磷酸核酮糖羧化酶（EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着CO2 的固定，同时又制约着碳素向Calvin 循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。

测定原理：

（1）在Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）与 1 分子的CO2 结合，产生 2 分子的 3-磷酸甘油酸（PGA）；（2）PGA 可通过外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，伴随着NADH 氧化生成NAD+；（3）在 340 nm NADH 有特征吸收峰，而NAD+没有此吸收峰，因此测定 340nm 吸光度下降速率可以代表Rubisco 的羧化酶活性。

组成：

BU6005-25T/24S 试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 12.5ml 试剂一，充分混匀待用；用不完的BU6005-25T/24S 试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

BU6005-25T/24S 试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 12.5ml 试剂一，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

BU6005-25T/24S 试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 1.25 ml 试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

BU6005-50T/48S 试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 25ml 试剂一，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

BU6005-50T/48S 试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 25ml 试剂一，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

BU6005-50T/48S 试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 2.5 ml 试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

（注意：试剂二、三、四溶解后，按需分装-20℃保存。）自备仪器和用品：

可见-紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

粗酶液制备：

①总 Rubisco 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1ml 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定。

②胞浆和叶绿体Rubisco 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5～10 的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1ml 提取液一），冰浴匀浆后于 4℃，200g 离心 5min，弃沉淀，取上清在 4℃， 8000g 离心 10min，取上清用于测定胞浆 Rubisco 酶活性，取沉淀加 1ml 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定叶绿体中Rubisco 酶活性。

建议测定总Rubisco 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的Rubisco，则按步骤②提取粗酶液。

（照注意：粗酶液制备过程中超声破碎操作使用细胞破碎仪进行。）测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三 1：1 混合，用多少配多少；

在 1ml 石英比色皿中加入 50ul 样本、50ul 试剂四和 900ul 工作液，混匀，立即记录 340nm 处 20s

时吸光值A1 和 5min20s 时的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

Rubisco 活性计算：

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 n mol NADH。

Rubisco（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T =643×ΔA÷Cpr 此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司生产的BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。 2、按样本鲜重计算

单位的定义：25℃中 1 g 组织 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样÷V 样总×W) ÷T=643×ΔA÷W

上述计算公式中各符合含义：

V 反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.05 ml；V 样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，5 min；W：样本质量，g。

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