C4H 催化肉桂酸和NADP 生成 4-香豆酸盐和NADPH，在 340nm 下测定NADPH 生成速率，即可反映C4H 活性。
肉桂酸-4-羟化酶试剂盒 其他系列

肉桂酸-4-羟化酶（ Cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H)试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

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正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

C4H 又称反式肉桂酸-4-单氧化酶，多存在于高等植物、酵母、菌类中，该酶催化肉桂酸羟化作用产生4-香豆酸盐，是苯bing烷途径中继L-苯bing氨酸解氨酶之后的第二个关键酶。

测定原理：

C4H 催化肉桂酸和NADP 生成 4-香豆酸盐和NADPH，在 340nm 下测定NADPH 生成速率，即可反映C4H 活性。

试剂的组成和配制：

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

粗酶液提取：

细菌或培养细胞：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：

按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

取试剂二一瓶，加入 10ml 试剂一充分溶解混匀，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；现配现用（配好后 24h 内用完）；

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 样本和 190μl 试剂二，混匀，立即记录 340nm 处初始吸光值A1 和 5min 后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

C4H 活性计算：

用微量石英比色皿测定的计算公式如下

按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

C4H（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

C4H（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W

按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

C4H（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.286×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

用 96 孔板测定的计算公式如下

按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

C4H（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

C4H（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W

按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

C4H（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.572×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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