本制品使用通过基因重组技术克隆表达的点突变型RNase H活性缺失的 M-MuLV反转录酶。野生型的M-MuLV 包含的RNase H活性能够催化降解DNA/RNA杂合体中的RNA，因此在cDNA第一条链的合成反应中可能会降解RNA/DNA杂合体中的模板RNA。
M-MuLV Reverse Transcriptase反转录试剂

诺博莱德 M-MuLV Reverse Transcriptase反转录试剂

Script III M-MuLV Reverse Transcriptase

目录号：71117

产品内容

保存条件：-20℃保存，有效期 12 个月

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

产品简介

本制品使用通过基因重组技术克隆表达的点突变型RNase H活性缺失的 M-MuLV反转录酶。野生型的M-MuLV 包含的RNase H活性能够催化降解DNA/RNA杂合体中的RNA，因此在cDNA第一条链的合成反应中可能会降解RNA/DNA杂合体中的模板RNA。本酶M-MuLV(RNase Hˉ)的RNase H活性缺失，与M-MuLV 相比，具有更强的延伸能力和稳定性，可用于较长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。

适用范围

第一链cDNA合成。可用于低拷贝基因的检测。

产品特点

合成cDNA片段长度最高可达12 kb。

引物的选择：

1. 如果RNA模板来源于真核生物，首xuanOligo (dT)，与真核生物mRNA的 3’PolyA尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。

2. 如果对一些物种，不能确定mRNA是否有polyA尾的情况下，首xuanOligo (dT)，不成功再尝试基因特异性引物(GSP)和Random primer为引物。

3. 基因特异性引物(GSP)的特异性较高。但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成，可改用Oligo (dT)或Random primer重新进行逆转录。

4. Random primer特异性最di，所有RNA，包括mRNA，rRNA，tRNA均可以作为Random primer的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，使用Oligo (dT)或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成时，可使用Random primer为引物。

5. 如果合成cDNA下游用于qPCR，可将Oligo (dT)与Random primer混合使用（各加1μl /20μl反应体系），可使mRNA的各个区域cDNA合成效率相同，有助于提高qPCR结果的真实性和重复性。

第一连 cDNA 合成 (以 20 μl 反应体系为例)

1.反应体系的配制

操作前，请将各组分轻弹混匀，点甩离心收集至管底，置冰上备用。

使用 RNase-Free PCR 管在冰上配制：

2．轻柔吸打混匀，点甩离心，置 PCR 仪进行逆转录反应。

如用Oligo(dT)18或基因特异性引物(GSP)，产物用于PCR：42℃孵育30 min；产物用于qPCR：42℃孵育15 min。

如用 Random Primer,25℃孵育10 min后，产物用于PCR，42℃孵育30 min；25℃孵育 10 min 后，产物用于 qPCR，42℃孵育 15 min。

注意：如果模板具有复杂二级结构或高 GC 区域，可以先只加 RNA模板、引物和 RNase free H2O，混匀，65℃变性 5 min，冰上冷却，点甩离心后加入其它成分，并将 42℃孵育温度提升至 50°C，有助于提高产量。

3． 85°C加热 5 sec，失活RTase和dsDNase，终止反应。

逆转录产物可立即用于PCR或qPCR反应，或保存于-20°C，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-70°C保存，cDNA应避免反复冻融。

PCR

建议取2 - 4 μl的cDNA产物原液作为PCR模板。

1. 常规扩增：71019-2x Taq PCR MasterMix (30sec/kb)

71800-2x Lightning Taq PCR MasterMix (10sec/kb)

2. 高保真扩增：71812-2x FastHiFi PCR MasterMix (≤3kb片段)

71814-2×LongHiFi PCR MasterMix (≤10kb片段)

qPCR

建议取1~2μl cDNA产物原液作为20μl qPCR反应体系的模板。如果基因表

达量较高，请根据实际情况适当稀释cDNA模板后使用。

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