转染级质粒大提试剂盒(溶液型) 核酸提取

EndoFree Plasmid Maxi Kit转染级质粒大量提试剂盒（溶液型）

目录号：31114-20

产品内容：

保存条件：

在室温 (15 ~ 25℃) 条件下，可保存 12 个月。

RNase  A、内毒素清除剂，可常温运输，-20℃保存。

适用范围：

特别适合用于大量转染级质粒的制备，以及 BAC/PAC 等大型质粒的制备。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

产品简介：

采用独te的溶液配方和内毒素清除试剂，只需要几次简单的离心，就可以去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA 等杂质，获得高质量的转染级质粒 DNA，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对 DNA 纯度要求很高的工作中。

本方法提取纯化质粒 DNA，对质粒损伤小，即使是 10kb 甚至 100kb 以上的大型质粒或超大型 BAC/PAC 质粒，都可以有效纯化。获得的质粒产量高，浓度可高达 5ug /ul，超螺旋比例可高达 95%，无内毒素，转染效果极jia。

重要提示：

一、环境温度低时溶液 P2 中 SDS 可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

二、提取大质粒时, 操作动作要轻柔，剪掉一部分吸头的尖嘴，以增大开口，防止机械剪切对 DNA 的损坏。

三、提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加 P1、P2、P3 的用量。

四、得到的质粒 DNA 电泳时可能为单一条带，也可能为 2 条或者多条 DNA 条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过 95%。

五、首ci使用时请先将 RNase A 全部加到溶液 P1 中，混匀，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。

操作步骤：

1.   取 150 ml（最多 200ml）过夜培养的菌液，12,000 x g 于 4℃离心 2 min，尽量倒干上清，收集菌体。

（注意： 如果用 50 ml 离心管收集菌体，离心弃上清后，在同一管内加入更多的菌液，重复步骤 1，直到收集到足够多的菌体）

2.  加入 5 ml 溶液P1，重悬菌体沉淀，涡旋震荡至彻di悬浮, 室温放置3~5分钟。

（注意：如有未彻di悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）

3. 加入 5 ml 溶液P2，温和地上下翻转 6-8 次，使菌体充分裂解，室温放置 4 min。

（注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组 DNA 片段的污染，所用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏，如未完quan变得清亮，可能是菌体太多，可增加溶液 P2 的用量，在后续的操作中溶液 P3 的用量也要相应增加）

4. 加入 5 ml 溶液P3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，至白色絮状物产生，然后

12,000 x g 于 4℃离心 10 ~ 15 min, 小心取上清，移入新的 50 ml 离心管中。

（注意：加入溶液 P3 后应立即混合，避免产生 SDS 的局部沉淀）

5.加入 10 ml 异丙醇，上下颠倒离心管，充分混匀。

6.   在 4℃条件下 12,000~16,000 x g 离心 10 min，小心弃去上清，倒置轻轻沥干残余液体，加入 3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，最高速离心 5 分钟，弃上清，晾干沉淀。

（注意：DNA 沉淀如果干燥过头，DNA 将无法完quan溶解，但是如果乙醇没有晾干挥发干净，残留太多，也会造成 DNA 无法完quan溶解。）

7.  加入 1.4 ml 溶液P1 完quan溶解沉淀团块，注意附着在侧壁上的质粒沉淀虽然看不见，也

要吹打侧壁涮洗下来（大质粒可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解）。然后将质粒溶液转入

2 个新的 1.5 ml 离心管中（每个 700 ul）。

8.        可选步骤（一般不需要）：如果菌株 RNA 丰富有微量 RNA 残留，可在此步骤后将质粒溶液 60℃孵育 15 min 消化 RNA。

9.每管加入 55 ul 杂质清除液 A，颠倒充分混匀后, 加入约 0.1 体积 (约 80ul ) 冰预冷的内毒素清除剂，颠倒旋转 7-10 次（30 秒左右）充分混匀，上清会变得浑浊，冰浴或者冰上放置>=5 min，中间偶尔颠倒混匀几次，上清恢复清亮。

(注意：如果不需要去内毒素用于转染，可在此步骤只加入 55 ul 杂质清除液A，充分混匀后冰上放置 5 分钟，离心后小心取上清转入一个新管，直接接步骤 12。)

10.     42℃水浴，溶液又会变为浑浊，颠倒混匀后 42℃温育 5 分钟。

11.     室温 14,000 x g 离心 5 min 分相，上层水相含 DNA，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA 的上层水相转移到新管（注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。

溶液必须分为上下两相，否则应重复步骤 10-11。

（温度低时，内毒素清除剂无法分相，因此必须 20℃以上室温离心或者保证冬季转头温度 20℃以上）

12.     将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液B（约 750 ul），轻柔混匀，14,000 x g于 4℃离心 10 min，弃上清（注意不要丢失 DNA），轻轻加入 1 ml 70%乙醇洗涤，离心弃上清，再用 1 ml 70%乙醇洗涤一次，室温倒置晾干 5~10 min 使乙醇完quan挥发。

13.     每个离心管加 100~200 ul 纯水或者 TE 溶解沉淀（可在 37℃水浴中振荡以辅助溶解）。要注意很多质粒 DNA 可能附着在离心管侧壁上，即使看不见，也应该充分吹打侧壁溶解回收质粒 DNA。（质粒 DNA 可以根据需要，选择任意小体积的纯水溶解，浓度可达 5-10ug/ul）

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