是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490nm,Em=515nm）。
Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒检测

NobleRyder CA9418 Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒Calcein-AM/PI，Live/Dead Cell Double Stain Kit

产品货号：CA9418

产品名称：Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒Calcein-AM/PI，Live/Dead Cell Double Stain Kit

英文名称：Calcein-AM/PI，Live/Dead Cell Double Stain Kit

产品规格：500T

Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒检测

产品简介：

储存条件：-20℃，避光，有效期1年。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

NobleRyder CA9418 Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒Calcein-AM/PI，Live/Dead Cell Double Stain Kit是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490nm,Em=515nm）。因其在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入yi酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein,AM细胞毒性极低，是最shi合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此，Calcein-AM 常常与死细胞荧光探针如碘化bing啶（PI）等联合使用，同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化bing啶（Propidiumiodide，PI）不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（Ex=535nm,Em=617nm），因此PI 仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545nm激发，仅可观察到死细胞。

本试剂盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据我司优化的实验体系，单次就100µL细胞悬液进行染色，可以做500次检测。

使用方法（仅供参考）：

1. 工作液的前处理

(1) 从低温冰箱内取出10×AssayBuffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水10倍稀释以得到1×AssayBuffer。

(2) 由于Calcein-AM 的稳定性受温度影响较大，建议收到货后，可分装为小份，密封避光保存于-20℃，不能反复冻融。若染色液经稀释，建议当天用完。

2. 细胞处理

(1) 悬浮生长的细胞，收集至离心管，450g ，离心5min，去除上清。用1x的AssayBuffer洗涤细胞，450g，离心5min，2次，去除残留酯酶。

(2) 贴壁细胞经0.25%yi酶-EDTA消化后，收集细胞，用1x的AssayBuffer洗涤细胞，450g，离心5min，2次，去除yi酶及残留的酯酶。

3. 染色步骤

(1) 离心得到的细胞沉淀用1×AssayBuffer重悬，使重悬后细胞悬液计数细胞量为1×105~6个/ml。

(2) 每1ml的细胞量加入1-2ul的Calcein-AM（原液），吹打混匀，37℃避光孵育 20min-25min。

(3) 将试剂盒自带的PI原液取3-5ul加入上述染色细胞中，室温避光染色5min。

(4) 孵育荧光后的细胞，450g，5min，离心去除染色液。

注：细胞进行荧光染色时建议全程避光。

(5) 用1x的PBS清洗细胞450g，5min，离心后用1xPBS重悬细胞，取3-5ul滴在洁净的载玻片上，用干净的盖玻片压片后，请及时荧光镜检。

(6)  荧光显微镜下使用490±10nm激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用545nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。

注意事项：

(1) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

(2) 贴壁细胞也可以不消化，直接去除培养基，经1×AssayBuffer浸洗2min，2次。按上述细胞量和染色液浓度比例进行染色，染色时间和染色液工作浓度可按实际检测调整。

(3) Calcein-AM 作用于细胞，一般细胞量在1×105-6个时，Calcein-AM的工作浓度基本在2-4µM（如遇镜检荧光亮度过强，稀释比例可适当调整在1:500到1:2000或更大）；PI的工作浓度在5µM左右。但由于不同细胞系的优良染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定 Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最di的探针浓度得到最hao的荧光结果。

(4) 碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作时一定要注意防护。若接触到皮肤，需要立即用自来水清洗。

注：可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料针对不同细胞的优良工作浓度。

a) 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地gao辛孵育细胞10min，或者用70%乙醇孵育细胞30min，从而制备死细胞；

b) 用0.1-10µM的PI溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的优良工作浓度。

c) 用0.1-10µM 的Calcein-AM 进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的优良工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。

Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒检测 

产品订购信息：

CA9418 Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒Calcein-AM/PI，Live/Dead Cell Double Stain Kit  500T